实用免疫细胞与核酸

• 一、抗体的制备和配制

• 二、组织材料的处理

• 三、免疫染色

• 四、对照

• 五、免疫细胞化学结果的判断

• 一、细胞和组织

• 二、细胞和组织的固定

• 三、组织切片技术

• 一、抗血清的制备

• 二、单克隆抗体的制备

◦ （一）动物的选择与免疫

◦ （二）细胞融合

◦ （三）选择杂交瘤细胞及抗体检测

◦ （四）杂交瘤的克隆化

◦ （五）杂交瘤细胞的冻存与复苏

◦ （六）单克隆抗体的大量生产

◦ （七）单克隆抗体的鉴定

• 一、直接法

• 二、间接法

• 三、补体法

• 四、双重免疫荧光标记法

• 五、对照试验

• 一、荧光素

◦ （一）异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate, GITC）

◦ （二）四乙基罗达明（tetraethylrodamineB200, RB200）

◦ （三）四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamineisothiocyanate, TMRITC）

• 二、荧光素标记抗体的方法

◦ （一）FITC标记抗体的方法

◦ （二）四乙基罗达明标记抗体方法

◦ （三）四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法

◦ （四）藻红蛋白标记抗体的方法

◦ （五）PE-标记蛋白A方法

◦ （六）蓝色荧光素标记抗体方法

• 三、荧光抗体质量控制

◦ （一）染色特异性和敏感性的测定

◦ （二）F/P比值的测定

• 四、荧光抗体的保存

• 一、标本制作

• 二、荧光抗体染色方法

◦ （一）直接法

◦ （二）间接法

◦ （三）补体法

◦ （四）膜抗原荧光抗体染色法

◦ （五）双重染色法

◦ （六）荧光抗体再染色法

• 三、荧光抗原染色法

• 一、荧光显微镜

◦ （一）光源

◦ （二）滤色系统

◦ （三）反光镜

◦ （四）聚光镜

◦ （五）物镜

◦ （六）目镜

◦ （七）落射光装置

• 二、荧光显微镜标本制作要求

• 三、使用荧光显微镜的注意事项

• 四、荧光图像的记录方法

• 一、非特异性染色的主要因素

• 二、消除非特异性染色的方法

◦ （一）动物脏器粉末吸收法

◦ （二）透析法

◦ （三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法

◦ （四）DEAE纤维素柱层析法

◦ （五）荧光抗体稀释法

◦ （六）纯化抗原法

◦ （七）纯化抗体法---免疫吸收法

◦ （八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法

• 一、固定

• 二、切片

• 一、本科标抗体法

◦ （一）酶的种类及特点

◦ （二）本科标抗体的制备（Boosma,DM, 1983）

◦ （三）酶标抗体的纯化

◦ （四）染色原理及步骤

• 二、非标记抗体酶法

◦ （一）酶桥法

◦ （二）PAP法

• 一、对照实验

• 二、假阳性及其处理

• 三、抗体有关事项

• 四、单克隆抗体

• 五、增加染色强度方法

• 一、ICC在铺片中应用

• 二、ICC的双重染色法

◦ （一）切片

◦ （二）染色

• 三、ICC在细胞功能研究中的应用

• 四、 ICC在原位杂交技术中的应用

• 一、胶体金

• 二、胶体金的一般性状

• 一、制备胶体金的准备

• 二、制备胶体金的方法和步骤

◦ （一）白磷还原法

◦ （二）抗体血酸还原法（Stathis and Fabrikanos 1958）

◦ （三）柠檬酸三钠还原法（Frens 1973）

◦ （四）鞣酸—柠檬酸三钠还原法（Slot与Gueeze1985年）

◦ （五）乙醇超声波还原法（Baigent and Muller 1980）

◦ （六）硼氢化钠还原法（Tschopp et al 1982）

◦ （七）放射性胶体金的制备方法（Kent and Allen 1981）

• 一、胶体金颗粒直径测定

• 二、胶体金金颗粒均匀度测定

• 三、影响胶体金颗粒大小的因素

• 一、待标记蛋白质的准备

• 二、胶体金pH值的调整

• 三、待标记蛋白质最适稳定量的测定

• 四、蛋白质的胶体金标记

• 五、胶体金标记蛋白质的纯化

◦ （一）调整与超速离心法

◦ （二）凝胶过滤法

• 六、免疫金探针的鉴定

• 一、固定剂的选择及固定时间（详见表5-9）

• 二、切片的处理与粘附。

• 一、免疫金染色

◦ （一）免疫金法（IGS）

◦ （二）蛋白A-金（PAG）放大法

• 二、免疫金银法

◦ （一）石蜡切片的IGSS染色

◦ （二）冰冻切片的IGSS染色

◦ （三）半薄切片的IGSS染色

• 三、彩色免疫金银法（CIGSS）

• 四、免疫金及免疫金银技术的优点

• 五、在IGSS染色中常见技术问题和对策

• 六、物理显影液及缓冲液的配制

• 一、胶体铁的制备方法

• 二、抗体的标记和纯化

• 三、胶体铁标记抗体的鉴定

• 四、免疫胶体铁细胞化学染色

• 五、方法的应用

• 一、基本原理

• 二、几中抗生物素—生物素染色法

◦ 1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术（Avidin Biotin–Peroxidase Complex technique, 简称ABC技术）

◦ 2．桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术）

◦ 3．标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）

• 一、SPA的性质

• 二、SPA的应用

• 三、SPA在免疫细胞化学染色中的应用

• 一、凝集素的特性

• 二、凝集素的应用

• 三、凝集素在免疫细胞化学中的应用

• 四、HRP标记凝集素及凝集素抗体的制备

• 一、组织固定与取材

• 二、免疫染色

• 三、包埋

• 四、对照试验

• 一、基本原理

• 二、铁蛋白的提取和纯化

• 三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合

• 四、电镜标本的制备方法

• 一、基本原理

• 二、电镜标本制备方法

◦ 1．单层细胞培养物免疫酶染色法

◦ 2．组织切片酶标记抗体染色法

◦ 3．PAP包埋前染色法（Pickel 等，1975）

◦ 4．PAP包埋后染色法（Ordronneau, 1982）

◦ 5．PAP免疫电镜双重标记

• 一、电镜水平的免疫金染色法

◦ 1．包埋后染色

◦ 2．包埋前染色

• 二、胶体金标记蛋白A技术（Protein A-goldtechnique, PAg法）

◦ 1．蛋白A—金（PAg）复合物的制备（Slot 和Geuze,1981）

◦ 2．

• 三、胶体金双标记技术（常用为蛋白A—胶体金）

• 四、免疫电镜金—银法染色技术

• 一、凝集素电镜标记技术

• 二、扫描免疫电镜技术

◦ （一）标记物

◦ （二）免疫标记方法

◦ （三）扫描免疫电镜的具体操作步骤

• 三、冷冻蚀刻免疫电镜技术

◦ 1．冷冻蚀刻表面标记免疫电镜技术

◦ 2．断裂—标记免疫电镜技术

• 一、放射免疫分析的优缺点

• 二、基本原理

• 一、同位素的选择

• 二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记

◦ （一）氯胺T法

◦ （二）乳过氧化物酶法（LPO）

◦ （三）Iodogen碘化法

◦ （四）酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法

• 三、放射性标记化合物的纯化与鉴定

◦ （一）纯化标记化合物的常用方法

◦ （二）标记化合物的主要质量指标

• 一、对分离方法的要求

• 二、常用的分离方法

• 一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取（以大鼠为例）

• 二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法（以下丘脑为例）

• 三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取（以胃粘膜为例）

• 四、血浆

• 五、脑脊液

• 六、尿

• 七、胃液

• 一、放射免疫分析的基本试剂

• 二、加样程序

• 三、放射免疫分析的质量控制

• 一、流式细胞术发展简史

• 二、流式细胞计的基本结构和工作原理

• 一、FCM应用的技术途径

• 二、FCM的典型应用简介

• 一、白细胞的免疫荧光标记技术

• 二、白细胞免疫荧光分析的数据分析

• 三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义

• 一、细胞骨架中的中间丝蛋白

◦ （一）神经细丝酸性蛋白

◦ （二）神经细丝

• 二、神经特异性烯醇化酶

• 三、S—100蛋白

• 一、生体腺瘤

• 二、胰岛细胞瘤

• 三、甲状腺髓样癌

• 四、肺支气管类癌及肺小细胞癌

• 五、食管燕麦细胞癌

• 六、皮肤神经内分泌癌（Merkel细胞瘤）

• 一、常用标记抗体

• 二、软组织肿瘤免疫组织化学

• 三、骨及软骨肿瘤免疫细胞化学标记

• 一、免疫活性细胞的免疫细胞化学

◦ （一）B淋巴细胞

◦ （二）T淋巴细胞

◦ （三）NK细胞/K细胞

◦ （四）单核/巨噬细胞与网状细胞

• 二、恶性淋巴瘤的免疫细胞化学标记

◦ （一）恶性淋巴瘤与淋巴网状组织反应性增生的鉴别诊断

◦ （二）恶性淋巴瘤与非淋巴瘤网状组织肿瘤的鉴别

◦ （三）恶性淋巴瘤的免疫细胞分型

◦ （四）在恶性淋巴瘤免疫表型分析中的注意事项

• 一、角蛋白

• 二、器官特异性及其它瘤标记物

◦ （一）上皮膜抗原

◦ （二）桥粒蛋白

◦ （三）癌胚抗原

◦ (四)甲胎蛋白

◦ （五）前列腺特异性抗原和前列腺酸性磷酸酯酶

◦ （六）CA19-9及CA50

◦ （七）CA125

◦ （八）神经元特异性烯醇化酶

◦ （九）甲状腺球蛋白和降钙素

◦ （十）血型抗原

• 一、抗原的稳定性

• 二、抗体的特异性

• 三、染色技术的选择性

• 四、结果的可比性

• 一、抗体产生细胞的特点

• 二、双标记免疫荧光染色

• 三、临床意义

• 一、S IgA合成及其功能

• 二、对比免疫荧光染色

• 三、临床意义

• 一、T淋巴细胞分布及其特点

• 二、研究方法

• 三、临床意义

• 一、癌胚抗原的特点

• 二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色

• 三、临床意义

• 一、溶菌酶在胃肠道的分布

• 二、溶菌酶的免疫细胞化学染色特点

• 三、溶菌酶的研究的临床意义

• 一、内源性神经的结构

• 二、消化道全层铺片技术

• 一、乙型肝炎免疫细胞化学

• 二、肝硬变免疫细胞化学

• 三、肝癌免疫细胞化学

• 一、肾脏组织的检查

• 二、血清或肾脏洗脱液的检查

• 三、尿液的检查

• 四、肾小球细胞的体外培养

• 一、肾小球毛细血管壁

• 二、肾小球系膜区

• 三、肾小球毛细血管壁及系膜区

• 四、新月体性

• 五、肾小球球囊腔

• 六、肾小管

• 七、小动脉

• 八、紧间质

• 一、免疫荧光或免疫酶标技术在肾脏疾病中的应用的意义

• 二、免疫电镜技术在肾脏疾病中应用的意义

• 一、原发性肾小球疾病

• 二、继发于全身性疾患的肾小球疾病

• 三、结缔组织病时的肾脏损害

• 四、血管性疾患导致肾脏的损害

• 五、代谢性疾患引起的肾脏损害

• 六、某些特殊疾病时的肾脏损害

• 七、遗传性和先天性肾病

• 八、杂病

• 九、肾移植

• 十、肾小管间质性疾病

• 一、抗核抗体（Antinuclearantibodies, ANA）的检测

• 二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用

• 三、抗核仁抗体的检测法

• 四、抗组蛋白抗体的检测方法

• 五、抗着丝点抗体的检测方法

• 六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法

• 七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测

• 八、肝细胞膜抗体（Antibodyto the hepatocyte membrane, HMA）的检测

• 九、线粒体抗体（Mitochondrial antibody, AMA）

• 十、胃壁细胞抗体（Gastricparietal cell antibodies, PCA）的检测

• 十一、胃泌素细胞抗体（GastrinCell antibodies, GCA）的检测

• 十二、胰岛细胞抗体（Isletcell antibady, ICAb）的检测

• 十三、抗肾小球和肺泡基底膜抗体的检测

• 十四、抗皮肤成分自身抗体的检测

• 十五、唾液腺外分泌导管上皮自身抗体的检测

• 十六、抗横纹肌自身抗体的检测

• 十七、肾上腺自身抗体的检测

• 十八、类风湿因子（Rheumatoidfactor）的检测

• 十九、抗中性白细胞胞浆自身抗体（Anti－eutrophilcytoplasmic autoantibody ANCA）

• 二十、增殖细胞核抗原抗体（Proliferativecell nuclear antigen antibody, PCNA）

• 二十一、抗类风湿关节　炎相关核抗原的抗体（Antirheu－matoidarthritis associated nuclear antigen antibody, RANA）

• 二十二、抗精子抗体（Anti-spermantibody, ASA）

• 二十三、其他自身抗体的检测

• 一、自身淋巴细胞免疫调控反应紊乱学说

• 二、T细胞旁路（t cell by - pass）学说

• 三、独特型-抗独特型网络缺陷学说

• 四、遗传因素

• 一、甲组溶血性链球菌的快速检查法

• 二、脑膜炎双球菌的快速检查法

• 三、霍乱弧菌和副霍乱弧菌的快速检查法

• 四、鼠疫杆菌的快速检查法

• 五、炭疽杆菌的快速检查法

• 六、致病性大肠杆菌的快速检查法

• 七、结核杆菌的快速诊断方法

• 八、其他细菌的快速检查方法

• 九、钩端螺旋体的检查法

• 十、梅毒螺旋体的检查法

• 一、病毒抗原定位

• 二、病毒感染过程

• 三、肿瘤与病毒

• 四、病毒计数

• 一、血吸虫病

• 二、疟疾

• 三、阿米巴病

• 四、锥虫病

• 五、丝虫病

• 六、弓形虫病

• 七、旋毛虫病

• 八、其他寄生虫病

• 一、对角质层抗原与角质层自身抗体、角蛋白抗原的研究

• 二、对天疱疮的研究

• 三、HLA-DR抗原

• 四、凝集素受体

• 五、其它

• 一、正常黑素细胞

• 二、色素痣

• 三、恶性黑素瘤

• 一、免疫细胞化学在Merkel细胞起源和功能认识中的作用

• 二、Merkel细胞癌的免疫细胞化学诊断

• 一、研究LC自身的表面标记

• 二、研究皮肤病中LC数量、密度及结构的改变

• 一、基底膜带

• 二、狼疮带试验（LupusBand Test, LBT）

• 一、确定细胞外基质成分在真皮的分布

• 二、研究纤维化皮损中细胞的表型特征和（或）功能状态

• 三、检测与纤维发生有关的细胞因子

• 四、其它

• 一、T淋巴细胞及其亚群的免疫表达

• 二、B淋巴细胞和免疫球蛋白的表达

• 三、其它

• 一、核酸的化学组成

• 二、核酸的一级结构

• 三、核酸的高级结构

◦ （一）DNA

◦ （二）RNA

• 四、基本组织

• 一、DNA变性

• 二、复性

• 一、概述

• 二、探针-靶反应

• 三、核酸探针的种类

◦ （一）DNA探针

◦ （二）cDNA探针

◦ （三）RNA探针

◦ （四）寡核酸探针

• 四、核酸探针的标记和检测（详见每十九章　）

◦ （一）核酸探针的常用酶促标记技术

◦ （二）核酸探针的非放射性标记技术

◦ (三）非放射性探针的显示体系

• 五、核酸分子杂交的类型

◦ （一）固相膜核酸分子杂交方法

◦ （二）固相核酸分子杂交类型

◦ （三）固相膜核酸杂交的几点说明

◦ （四）液相核酸分子杂交类型

• 六、核酸分子杂交实验因素的优化

• 一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法

• 二、影响DNA提取质量的因素

• 三、提高DNA提取质量的方法

• 四、石蜡包埋组织DNA分析的方法学

• 五、分子病理学研究中的应用

• 一、特异性目的核酸（或基因）的制备

• 二、目的核酸的扩增

• 一、缺口平移法

• 二、末端标记法

• 三、应用特异单引物法标记DNA探针

• 四、双引物法标记DNA探针法

• 五、聚合酶链反应（PCR）标记高活性DNA探针

• 一、生物素标记核酸探针方法

• 二、光敏生物素标记核酸探针

• 三、生物素-补骨脂素（Biotin -psoralen）标记法

• 四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法

• 五、缺口平移法标记生物素DNA探针（二步法）

• 六、生物素随机引物标记探针方法

• 七、异羟基洋地黄毒甙（Digoxigenin）标记核酸探针

• 八、光敏2，4-二硝基苯（光敏DNP）标记DNA法

• 九、三硝基苯磺酸（TNBS）标记核酸探针

• 十、生物素化的RNA探针标记

• 十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法

• 十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针

• 一、核酸分子杂交技术

• 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展

• 三、原位杂交组织化学技术的基本方法

• 一、同位素标记cRNA探针在ISHH中的应用

• 二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用

• 三、地高辛标记cRNA探针的应用

• 一、DNA探针的应用

• 二、寡核苷酸探针的应用

• 一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序

• 二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法

• 一、PCR与原位杂交细胞化学结合法

• 二、快速原位杂交细胞化学技术

• 三、原位启动标记法

• 一、有关染色体的基本知识及制片

◦ （一）染色体的形态结构

◦ （二）染色体G显带技术

◦ （三）高分辨染色体G带技术

◦ （四）外周血培养及染色体制片技术

• 二、应用ISHH技术对染色体制片、基因分配（Chromosomalassignment of genes）的研究

• 三、利用ISHH技术对肿瘤或癌前组织的细胞间期染色体铺片进行研究

• 四、利用性染色体特异性DNA探针的ISHH技术

• 一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片（Hutchison et al,1982）

• 二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术

• 三、应用地高辛标记rRNA探针的电镜原位杂交技术

• 四、结语

• 一、PCR操作范例

• 二、PCR反应系统的组成

◦ （一）PCR缓冲液（PCrBuffer）

◦ （二）四种脱氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs）

◦ （三）引物的量

◦ （四）TaqDNA聚合酶的量

◦ （五）模板

◦ （六）石蜡油

• 三、电泳分析

• 一、温度循环参数

• 二、引物引物设计

• 三、DNA聚合酶

• 四、影响PCR特异性的因素

• 五、扩增平坡

• 一、兼并引物（DegeneratePrimer）PCR

• 二、套式引物（NestedPrimer）PCR

• 三、复合PCR（Multiplex PCR）

• 四、反向PCR（Inverse PCR或Reverse PCR）

• 五、不对称PCR（Asymmetric PCR）

• 六、标记PCR（LP-PCR）和彩色PCR

• 七、加端PCR

• 八、锚定PCR或固定PCR

• 九、玻片PCR

• 十、反转录PCR方法检测RNA

• 十一、定量PCR

• 一、样品处理

• 二、注意事项

• 一、PCR应用特点

• 二、PCR应用领域

• 一、免疫PCR

• 二、转录依赖的扩增系统（Transcription-basedAmplification System , TAS）

• 三、再生式序列复制技术（3SR）

• 四、连接酶链式反应（Ligase ChainReaction,LCR）

• 五、PCR-SSCP分析技术

• 六、结语

• 一、DNA限制性内切酶

• 二、甲基化酶

• 三、分子克隆化的另一些酶

◦ （一）DNA聚合酶

◦ （二）RNA聚合酶

◦ （三）反转录酶

◦ （四）核酸外切酶

◦ （五）核酸酶S1

◦ （六）DNA酶

◦ （七）RNA酶

◦ （八）连接酶

◦ （九）末端转移酶

◦ （十）碱性磷酸酶

• 一、质粒

◦ （一）大肠杆菌质粒

◦ （二）真核生物中的质粒

• 二、噬菌体和病毒载体

◦ （一）噬菌体λ载体的构建

◦ （二）单链噬菌体载体

◦ （三）猴病毒40（SV40）

◦ （四）逆转录病毒

• 三、柯斯质粒

• 四、其他载体

◦ （一）转座子载体

◦ （二）人工微小染色体

• 一、质粒DNA的提取及鉴定

• 二、DNA的重组

• 三、地高辛配基随机标记DNA探针法

• 四、核酸的分子杂交

• 五、真核细胞基因组DNA的制备

• 六、转移基因

• 一、分离基因进行结构分析

• 二、DNA限制性片段多态性连锁分析

• 三、聚合酶链反应

• 一、固定剂

• 二、缓冲液

• 三、显色液

• 四、粘附剂

• 五、封固剂

• 六、酶消化液

• 七、其它

• 一、杂交前准备

• 二、关于探针的标记

• 三、固定剂

• 四、LB培养基

• 五、小量质粒提取主要液体

• 六、杂交前处理

• 七、杂交用液

• 八、杂交后漂洗溶液

• 九、原位杂交信号显示

• 一、国内实验室应用试剂配制

• 二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）

• 一、核酸及蛋白质常用数据

• 二、常用缓冲液

• 三、常用酶的配制

• 四、常用抗生素溶液

• 五、常用贮存液的配制

• 六、常用凝胶的技术参数

• 七、氨基酸的特性

• 八、遗传密码

• 九、常用酸碱技术参数

• 十、放射性核素数据

• 十一、原子量